过表达基因的方法

过表达载体构建方法

过表达载体构建方法介绍如下：1 可以用酶切连接法（传统），也就是将目的基因和载体都用相同的限制性酶（或同尾酶）酶切，然后用T4连接酶连接，转化到感受态细胞，筛选出阳性克隆；2 重组法，利用同源重组将外源基因整合到表达载体，外源基因可以先联到一个含重组位点的中间载体，然后用重组酶将其置换到表达载体，转化到感受态细胞，筛选出阳性克隆。拓展介绍过表达载体主要是将目的基因的编码区（CDS）构建到相应的质粒或者病毒载体中，达到在目的基因过量表达的作用。过表达载体的主要元件：Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗药筛选gene。花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S是组成型启动子，具多种顺式作用元件。其转录起始位点上游－343～－46bp是转录增强区，－343～－208和－208～－90bp是转录激活区，－90～－46bp是进一步增强转录活性的区域。Mitsuhara等利用CaMV35s核心启动子和CaMV 35S启动子的5＇端不同区段与烟草花叶病毒的5＇非转录区(omega序列)相连，发现两个CaMV 35S启动子－419～－90序列与omega序列串联后，将GUS构建在该启动子后面转入植株中，获得很高的GUS表达活性。另一种高效的组成型启动子Cs-VMV是从木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus，CsVMV)中分离的。该启动子－222～－173bp负责驱动基因在植物绿色组织和根尖中的表达。在双子叶植物中过量表达某个目的基因大多采用人工改造后的CaMV 35S启动子，在单子叶植物如水稻中常采用泛素启动子。除了上面提到的高效表达的组成型启动子外，在植物发育生物学研究中经常使用的还有组织特异性表达启动子，如根特异启动子mas2、叶肉细胞特异启动子C4Pdk和种子特异启动子napinB等。

为什么要构建表达载体

1、得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。2、测序需要。你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。你要写论文必须要给人真凭实据。