质粒拯救

几种常用木霉遗传转化方法的比较

对于木霉菌来讲，除醋酸锂的转化方法鲜有报道外，其余转化均有在木霉中成功的例证，其中又以PEG介导的原生质体转化、电激法转化、根癌农杆菌介导转化和限制酶介导整合转化四种方法最为常用，在这四种方法中PEG介导的原生质体转化和限制酶介导整合转化是需要制备原生质体的，原生质体的制备是转化中的一大难点，原生质体制备方法大同小异，但要制备数量多、质量高的原生质体，并能成功转化需要注意脱壁酶的选择、菌丝龄的大小、细胞预处理、高渗液、再生率、融合频率等因素的影响。原生质体PEG转化法对各种菌的转化率有一定的差异，虽然操作简便，但也存在转化率低、不稳定、细胞易聚合产生二倍体甚至多倍体等问题；而限制酶介导的插入转化法相较PEG法则具有操作简便，转化效率高，并且单拷贝插入多，突变子稳定的优点。电激法转化和根癌农杆菌介导转化可以不制备原生质体，可以以菌丝或孢子作为受体细胞进行转化是其相较前两种方法最大的优点，经典的电激法转化法通常是需要制备原生质体的，但对丝状真菌原生质体的转化效率并不高，限制了其应用。但2012年Schuster通过改良，实现了利用木霉菌丝进行电激法转化的方法，为电激法转化的应用提供新的契机。根癌农杆菌介导的丝状真菌转化与其他方法相比，主要优点是：①不用制备原生质体，受体细胞来源简单，孢子、菌丝均可，操作过程简便。②转化率高，T-DNA整合入染色体时是随机的，并且一般是单拷贝。使得T-DNA可以作为丝状真菌基因突变研究中的一个标记使用，方便基因功能研究和基因克隆。③采用分生孢子作为受体细胞转化，由于分生孢子是单核，转化得到的后代不会发生分离现象，因此转化子稳定性好。④这一转化方法有可能用于外源基因的表达。目前，已经有大量的成功的根癌农杆菌介导转化实例，它可能成为工农业重要丝状真菌分子遗传学研究的重要手段之一，并将产生深远的影响。表8.1列出了2001年以来发表的木霉成功转化的实例。表8.1 木霉遗传转化实例续表续表续表续表注：P表示PEG介导的原生质体转化；E表示电击转化；R表示限制酶介导整合；A表示根癌农杆菌介导的转化；G表示基因枪法。hph表示潮霉素磷酸转移酶基因；admS表示Aspergillus nidulans乙酞胺酶；Pyr4表示乳清苷-5’-磷酸脱羧酶；bml表示苯菌灵抗性基因；argB表示鸟氨酸氨甲酞转移酶基因；ble表示腐草霉素抗性基因。

质粒拯救的主要原理

利用合适的限制性内切酶消化含有T-DNA插入的基因组DNA，直接用连接酶对消化产物连接环化，然后用高效的电击转化方法将连接产物转化大肠杆菌，通过抗性筛选获得阳性克隆，测序分析即可得到T-DNA的侧翼序列。质粒拯救技术的应用和载体的自身条件有很大的关系，首先要选用合适的载体，用于提供拯救质粒在转化宿主细胞中的复制起点和阳性克隆筛选基因，其次选用合适的核酸内切酶切基因组DNA，环化后得到一个只含有目的片段和抗性筛选基因的微笑质粒即拯救质粒利用质粒拯救的方法比较直接，不受分离侧翼序列的分子量大小的制约，其目的性和准确性都很强，在早期作为一种克隆基因的方法被广泛用于果蝇、真菌、哺乳动物和拟南芥中，比较常用于从突变体中克隆基因。但是，质粒拯救的最大缺点就是应用范围受载体制约，应用范围较窄；在操作过程中与基因组DNA质量、酶消化、连接、大肠杆菌转化效率等各个环节密切相关，操作繁琐，费时费力；阳性克隆不能判断是否为相同的连接产物，往往造成重复测序；假阳性克隆比例较高，筛选繁琐，工作量大。因此，质粒拯救法已经不能够胜任功能基因组学时代的高通量的要求，只能作为其他分离方法无效时的一个补充。

限制性内切酶的目的基因的来源

限制性内切酶的目的基因的来源
限制酶主要是从原核生物中分离出来的.到目前为止,细菌是限制酶,尤其是特异性非常强的I类限制酶的主要来源.
限制作用实际就是限制酶降解外源DNA ,维护宿主遗传稳定的保护机制.具有限制酶的细菌有一定的防御病毒侵染的能力,因为如果侵入细菌的病毒DNA或RNA中有该酶识别的序列,就会被切割,从而保护了细菌本身的DNA.

【求助/交流】未知序列如何测得基因全长？如何从全长中筛选目的基因

tianpingpe(站内联系TA)你的问题好笼统，一般情况是将你要做的东西，丢到ncbi里面进行搜索，然后收集序列，最好选择与你做的基因的来源亲缘关系近的物种，选择出来后在ncbi中进行blast进行比对，然后找到保守序列，设计简并引物，可以从基因组中扩增也可以从rna进行扩增，如果扩增的得到的不是全基因序列，可以用walking等方法扩增得到全基因序列。得到序列后你就可以进行转化表达，分析功能了你的问题好笼统，一般情况是将你要做的东西，丢到ncbi里面进行搜索，然后收集序列，最好选择与你做的基因的来源亲缘关系近的物种，选择出来后在ncbi中进行blast进行比对，然后找到保守序列，设计简并引物，可以从 ... 主要是亲缘物种没有可利用的相关信息，在ncbi中无相关资料。我有一点不太明白，请赐教：RACE法得到的全长序列是指基因组序列全长还是目的基因序列全长，谢谢了。对于测序前的工作思路已基本清晰，谢谢你。那测序后要怎么分析搞不清楚了，怎样确定我得到了目的基因序列全长。

由cDNA全长怎么得到DNA全长

以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA。步骤的话应该与DNA复制过程类似，需要的原料是mRNA模板，四中脱氧核糖核苷酸，逆转录酶，还有能量，注意：这样获得的DNA片段不含非编码区序列。以下是专业回答一).构建cDNA文库：以生物细胞的总mRNA为模板，用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是cDNA文库。1、mRNA的提取及其完整性的确定1）总RNA的提取RNA提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2）mRNA的分离高等真核生物mRNA分子的3'端均有poly(A)尾，将总RNA通过寡聚（DT）纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。3）mRNA的纯化①按照大小对总mRNA进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。4）mRNA完整性的确定确定mRNA完整性的方法有三种：①直接检测mRNA分子的大小；②测定mRNA的转译能力；③检测总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力。2、cDNA的合成和克隆1）cDNA第一链的合成用亲和层析法得到mRNA后，根据mRNA分子的3'端有poly(A)尾结构的原理，用12~20个核苷酸长的oligo（dT）与纯化的mRNA混合，oligo（dT）会与poly(A)结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条RNA-DNA的杂交链。oligo（dT）结合在mRNA的3'端，因此合成全长的cDNA需要反转录酶从mRNA分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是mRNA链很长时，为此建立了一种随机引物法合成cDNA。随机引物是一种长度为6~10个核苷酸，由4种碱基随机组成的DNA片段。与oligo（dT）仅与mRNA3'端结合不同，它们可以在mRNA的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是RNA-DNA的杂交体。把cDNA克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的RNA转变成DNA链，即形成双链DNA分子。2）.双链cDNA的合成合成cDNA第二条链有两种方法。一种方法是利用cDNA第一链的3'末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成cDNA第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链cDNA在一端有一个发夹环，可以用单链特异的S1核酸酶切去。但是S1核酸酶的处理，常常会“修剪”过多的cDNA顺序，使cDNA丢失了mRNA5'端的部分顺序。另一种方法是用大肠杆菌的RNaseH进行修饰。RNaseH能识别RNA-DNA杂交分子并把其中的RNA切割成短的片段，这些RNA短片段仍与cDNA第一链结合，可被新合成的DNA所取代。新合成的DNA存在切口，用DNA连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的DNA链。RNaseH法优于S1核酸酶法，它能获得包括mRNA5'端全部或绝大部分的更长顺序cDNA分子。3）将cDNA重组到载体上合成的cDNA与载体DNA进行连接一般有3种方法：①借助于末端转移酶的3'-OH端合成均聚物的能力，双链cDNA和线性化载体DNA的3'-OH端分别加上均聚核苷酸链；②双链cDNA和线性化载体DNA分别用Klenow片段进行末端补平，然后用T4DNA连接酶进行齐头连接，形成重组体；③通过粘性末端连接。4）.转化重组的载体DNA分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的DNA含有不同的cDNA基因时，整个转化子含有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这样的转化子群体构成该mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。5）.目的cDNA克隆的鉴定用于从cDNA文库中筛选和鉴定目的cDNA的方法主要有3种：①核酸杂交②免疫学杂交检测③cDNA同胞选择

植物转基因的根癌农杆菌介导转化法是怎样做的？

根癌农杆菌（emphasis：role=italicAgrobacterium：tumefaciensemphasis）是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤（crown：gall：tumor）。根癌农杆菌细胞中含有Ti质粒，通过侵染植物伤口进入细胞后，将T-DNA插入到植物基因组中，因此，根癌农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助根癌农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。